Het St. Jobsgasthuis is gesticht in 1504 door Willem van Huesden (vermeld in 1521 als 'eerste fundateur' *  ). Bij akte van 16 februari 1504 erkennen de procurators van het gasthuis, dat de pastoors der Buurkerk vergunning hebben gegeven tot de stichting eener kapel *  ; de stichtingsbrief werd op 20 oktober 1505 door bisschop Frederik van Baden geconfirmeerd. *  Den 1en mei 1506 is de broederschapsbrief van het gasthuis opgemaakt. *  Het gasthuis werd bestuurd door twee huismeesters, waarvan jaarlijks de eene aan de broederschap rekening deed en aftrad. Het gasthuis was volgens den bisschoppelijken confirmatiebrief bestemd tot verpleging van poklijders. Het was aanvankelijk blijkbaar zeer populair; want eene ampliatie van den broederschapsbrief d.d. 1522 beperkte de broederschap tot 50 broeders en 25 zusters *  ; er werd trouwens voor de boeren zondags getapt. * 

In den oorlog onder den elect Hendrik van Beyeren is het gasthuis met de kapel verbrand; de stadhouder vergunde in 1530 eene collecte te doen, om den herbouw te bekostigen *  ; het gasthuis is toen herbouwd, de kerk in 1539. * 

In 1538 waren er in het gasthuis 18 bedden 'voor borgers ende andere ziecken'. *  Deze bedden dienden volgens het genoemde octrooi van den stadhouder van 1530, om 'die arme menschen te alimenteren (ende) van heuren seeren ende siecten (te) cureren'; 'de medicijn, die den armen smeert' in het gasthuis, ontving in 1562 een tractement uit de nalatenschap van Agnes van Leeuwenberch. *  Aldus bleef het: bij raadsbesluit van 8 november 1613 stelde de raad een chirurgijn aan, om 'persoonen besmet met morbus gallicus' in het St. Jobsgasthuis te cureeren, en een bord, dat nog in 1645 in het gasthuis aanwezig was, sprak van het 'genesen (van) Spaansche klieren en Napelsche sweeren'. *  Eerst bij besluit van de vroedschap van 21 februari 1649 werden regenten van de verplichting tot het genezen 'der geïnfecteerde met de Napelse sieckte' (of 'morbus gallicus') ontheven. In de praktijk waren de venerische zieken toen trouwens blijkbaar reeds lang op den achtergrond gekomen; want reeds in 1603 zegt Lapp van Waveren in zijne Memorie dat destijds in het St. Jacobsgasthuis 'alle arme siecken genesen' werden, die tevens 'haer volcomen nootdruft aldaer' hadden; terwijl er bovendien nog zestien bedden waren voor de arme passanten, die er ook voedsel kregen. * 

In den loop der 17e eeuw is het gasthuis, zooals alle anderen, tot een oudemannenhuis ingericht; vermoedelijk is daartoe in het begin van de 17e eeuw een nieuwe broederschapsbrief opgesteld, die verloren is: immers toen het St. Maartensgasthuis in de Weerd hare stichting in 1615 tot een oudemannenhuis wilde vervormen, betaalde de broederschap negen stuivers 'aent uutschryven van de wetten van St. Jobs-gasthuys, om daernae d'onse een weynich te dresseren', en het is niet aan te nemen, dat men zich in 1615 de regeling van 1506/ 1522, die iets geheel anders bedoelde, ten voorbeeld zal hebben gesteld. De onder nr. 2083 genoemde nieuwe ordonnantie, die in 1637 gedateerd is, vermeldt zoowel de in het gasthuis gehuisveste 'oude mannen' als de 'siecken ende andere arme persoonen int Gasthuys'.

Door het K.B. van 27 maart 1817 is het gasthuis, met de andere Utrechtse gasthuizen, gesteld onder beheer van regenten der Vereenigde gods- en gasthuizen.